基礎(chǔ)篇-無菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,無菌室及無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以70% ethanol擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后,才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株,且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后,將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái),以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后,再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置,其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出,以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70% ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域,勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全,須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作,并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過程中,應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生,小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等,并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項(xiàng)目:
5.1. CO2鋼瓶之CO2壓力。
5.2. CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。
5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜,預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng),3000小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。
基礎(chǔ)篇-實(shí)驗(yàn)用品
1. 種類:
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無菌,除了玻璃容器與pasteur pipet外,其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC級(jí)培養(yǎng)盤表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附,培養(yǎng)容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle等,依實(shí)驗(yàn)需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管:15 ml, 50 ml,均有2 種不同材質(zhì),其中polypropylene (PP)為不透明材質(zhì),polystyrene (PS)為透明材質(zhì),可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100ml,250ml,500ml,1000ml。
2. 清洗:
2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí),洗凈后才開始使用。
2.2. 用過之玻璃血清瓶,以高壓蒸汽滅菌,洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈,勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌:
3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋,高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘,置于oven中烘干。
3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet以干熱滅菌170℃, 4 小時(shí)。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 ℃, 15 lb, 20 分鐘處理。
基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃ 冰箱,避免光照,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37℃ 水槽中溫?zé)帷?
2. 液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個(gè)月,期間glutamine可能會(huì)分解,若細(xì)胞生長不佳,可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例):
3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清,因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml,pH為7.2-7.4。NaHCO3 為另外添加,若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH之誤差,或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合,然后用CO2氣體調(diào)整pH,而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH),因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長可能有影響,且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。
3.2. 材料:
純水(milli-Q水或二次至三次蒸餾水,水品質(zhì)非常重要),粉末培養(yǎng)基,NaHCO3,電磁攪拌器,無菌血清瓶,0.1或0.2 mm無菌過濾膜,pH計(jì),真空泵,CO2氣體
3.3. 步驟:
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q水中,攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中,攪拌使其溶解,然后通入CO2 氣體至飽和,約3-5分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?;旌笕芤褐畃H應(yīng)為7.2-7.4,除非pH值偏差太大,否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿,可再通入CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時(shí),pH會(huì)升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,同時(shí)分裝至無菌容器中,標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號(hào)等,貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗(yàn)與污染測試。
附-配制培養(yǎng)基之生長測試
材料:
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
步驟:
1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell,接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞,同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。
2. 接種5~7 天后,在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長,待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸時(shí)即可。
3. 去除培養(yǎng)基,加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),室溫下靜置10 min。
4. 去除固定液,水洗二次。
5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
6. 去除染液,水洗二次。
7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù),并比較之,若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長不佳,則丟棄之。
基礎(chǔ)篇-抗生素
1. 細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素
1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株,培養(yǎng)基中不加抗生素。
1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株,制作token freeze前培養(yǎng)基須添加抗生素,待token freeze通過污染測試后,大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。
2. 寄送活細(xì)胞時(shí),須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask時(shí),則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要檢測mycoplasma,則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin,因gentamicin會(huì)抑制mycoplasma生長。
4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方:penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 250ug/ml, bacitracin 2.5units/ml,注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。
5. 抗生素使用種類與濃度:
工作濃度. 儲(chǔ)存溫度. 殺滅細(xì)菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
基礎(chǔ)篇-血清
1. 血清必須貯存于–20~–70℃,若存放于4℃,請(qǐng)勿超過一個(gè)月。如果一次無法用完一瓶,可將40~45ml 分裝于無菌50ml離心管中,由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %, 必須預(yù)留此膨脹體積之空間,否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。
2. 一般廠商提供之血清為無菌,不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾,勿直接過濾血清。
3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法):–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天,至室溫下全溶后再分裝,一般以50ml無菌離心管可分裝40~45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一,減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56℃, 30 分鐘加熱已*解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須,一般不建議作此熱處理,因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多,且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有:cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
5. 勿將血清置于37℃太久,若在37℃放置太久,血清會(huì)變得混濁,同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞,而影響血清之品質(zhì)。
6. 血清之沉淀物
6.1. 凝絮物:發(fā)生之原因有許多種,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成,這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物,可用離心3000rpm, 5min去除,或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物,因?yàn)闀?huì)阻塞過濾膜。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”:通常經(jīng)過熱處理之血清,沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”,常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染,而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“,但在37℃環(huán)境下,又會(huì)使此沉淀物增多,更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖,但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測,又沒有污染。一般而言,此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長,但若懷疑此血清之品質(zhì),應(yīng)立即停用,更換另一批號(hào)的血清。
附-血清之生長測試
材料:
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
6-well TC plate (or 35mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
步驟:
1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于T75 flask 至80% confluency。
2. 以trypsin-EDTA 處理細(xì)胞,離心后,加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細(xì)胞懸浮液,并測細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1×102活細(xì)胞數(shù)/ ml。
3. 將1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate 中,并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM,使血清終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組試驗(yàn)。
4. 37 oC,5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天,期間不需更換培養(yǎng)基,待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸即可。
5. 去除培養(yǎng)基,加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),室溫下靜置10 min。
6. 去除固定液,水洗二次。
7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
8. 去除染液,水洗二次。
9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)
10. 計(jì)算SPE ( Serum Plating Efficiency ):
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
11. 計(jì)算RPE(Relative Plating Efficiency):
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE,即可得知待測血清對(duì)細(xì)胞生長的影響。訂購多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清,置于–70℃保存之
基礎(chǔ)篇-細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1. 細(xì)胞生長至高密度時(shí),即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中,一般稀釋比例為1:3 至1:6,依細(xì)胞種類而異。
2. 材料:
2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062):
以10ml 分裝于15ml無菌離心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃水槽回溫。
2.3. 新鮮培養(yǎng)基
2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
3. 步驟:
3.1. 附著型細(xì)胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
3.1.2. 用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37℃作用數(shù)分鐘,于倒立顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí),吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA,則在trypsin-EDTA作用后,加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用,離心后再吸掉上清液)。
3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落,加入適量之新鮮培養(yǎng)基,以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊,混和均勻后,依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液,放入離心管中,離心1000 rpm 5 分鐘。
3.2.2. 吸掉上清液,加入適量之新鮮培養(yǎng)基,混和均勻后,依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體,若是更換培養(yǎng)基,則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基,直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大,可傾斜放置,或分殖至新培養(yǎng)瓶中。
基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存
1. 注意事項(xiàng):
1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase)且存活率高之狀態(tài),約為80–90%致密度。
1.2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),無菌且無色(以0.22micronFGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10 ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。
1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度:
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3*106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后si去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。
1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5或10% DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗。
1.6. 冷凍方法:
1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10分鐘---> -20℃ 30分鐘---> -80℃ 16-18小時(shí)(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲(chǔ)存。
1.6.2. 程序降溫:利用等速降溫機(jī)以–1~–3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃,放在液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
2. 材料:
2.1. 生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞
2.2. 新鮮培養(yǎng)基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片
2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)
3. 步驟:
3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長情形。
3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,后濃度為5-10%,混合均勻,置于室溫下待用。
3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液((約0.1 ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
3.4. 離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,1 ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。
3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30分鐘→ -80℃ 16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。
3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中,再放入液氮槽中。程序?yàn)? program 7: HB CELL
基礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化
1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害,導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2. 細(xì)胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3. 材料:
37℃ 恒溫水,新鮮培養(yǎng)基,無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶,液氮或干冰容器
4. 步驟:
4.1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時(shí)蓋子易松掉。
4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 C水槽中回溫,回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.4 取出冷凍管,立即放入37 C 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,以70% ethanol 擦拭保存管外部,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.5 取出0.9 ml解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:10~1:15),混合均勻,放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。
4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol),依細(xì)胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。若要立即去除,則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1,000 rpm, 5 分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.7 若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (一)
1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí), 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形,若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開始培養(yǎng),或立即冷凍保存(置于–70 C,隔夜后,移到液氮)。
2. 冷凍細(xì)胞解凍程序:
2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它之成份和比例,制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類,若因?qū)嶒?yàn)需要,必須有所不同時(shí),務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成,確定細(xì)胞適應(yīng)后,方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清),對(duì)細(xì)胞而言差異極大,請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單之血清種類培養(yǎng)之。
2.3. 將培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫,回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管,立即放入37 C水槽中快速解凍,水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿,否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后,以70% ethanol 擦拭冷凍管外部,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
2.4. 依據(jù)細(xì)胞種類和濃度,于無菌操作臺(tái)內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入T25或T75 flask內(nèi)之培養(yǎng)基,混合均勻,放入37 C,5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.5. 對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言,1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO,不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響,不需立刻由解凍細(xì)胞中去除, 待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞,需立即去除DMSO 者, 則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中,離心300 xg (約1000 rpm),5分鐘,小心移去上清液,加入適量新鮮培養(yǎng)基,將細(xì)胞均勻混合后,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中, 再放入37 °C, 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (二)
收到T25 flask 細(xì)胞時(shí), 處理方式為︰
1. 于寄送過程中,為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡,T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請(qǐng)檢查flask 外觀,并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象,若有任何問題, 不要打開蓋子,請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。
2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C, 5 % CO2 培養(yǎng)箱中,使細(xì)胞回溫至37 °C, 并讓運(yùn)送過程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。隔天后,于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基,(取出之培養(yǎng)基可以再使用),僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi),依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中,或細(xì)胞已長滿盤, 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。
附-細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測試
1. 原理:
1.1. 計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coulter counter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
1.2. 血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers,每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1 mm2 大正方形,其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格,深度均為0.1 mm。當(dāng)chamber 上方蓋上蓋玻片后,每個(gè)大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時(shí),計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),再乘以104,即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。
1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion,利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色,而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整,染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料,如果細(xì)胞不易吸收trypan blue,則用紅色之Erythrosin bluish。
2. 材料:
0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip),計(jì)數(shù)器(counter),低倍倒立顯微鏡
粒子計(jì)數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步驟:
3.1. 取50ml細(xì)胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計(jì)數(shù)盤chamber 上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細(xì)胞不染色,死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色- Erythrosinbluish)。
3.3. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù),再除4,乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2,因與trypan blue等體積混合),后乘以104,即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上,只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
4 大格*細(xì)胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細(xì)胞數(shù)/ml
*每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球計(jì)數(shù)盤,可用Coulter counter作自動(dòng)計(jì)數(shù),惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。
3.5. 范例:
T75 monolayer culture制成10ml細(xì)胞懸浮液,取0.1 ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中,取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤,計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。
活細(xì)胞數(shù)/方格:55, 62, 49, 59
死細(xì)胞數(shù)/方格:5, 3, 4, 6
細(xì)胞總數(shù)= 243
平均細(xì)胞數(shù)/方格= 60.75
稀釋倍數(shù)= 2
細(xì)胞數(shù)/ml:60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細(xì)胞數(shù)/flask:1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率:225/243﹦92.6 %
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